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南京普朗匯編醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)技術(shù)
南京普朗匯編醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)技術(shù)
加入時(shí)間：2011-12-06 14:09:42 當(dāng)前新聞點(diǎn)擊率：6027
南京普朗醫(yī)療器械公司，檢驗(yàn)技術(shù)交流篇之-----醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)技術(shù) 醫(yī)學(xué)真菌學(xué)檢查是診斷真菌病的重要依據(jù)，隨著真菌感染病例的日益增多，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的診斷也提出了更高的要求。不論是患者淺部或深部感染診斷，幾乎全依賴于臨床標(biāo)本的真菌學(xué)檢查。特別是系統(tǒng)性真菌感染，其早期特異的診斷方法是挽救患者生命的關(guān)鍵，而病原真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)十分多樣，在不同條件下同一真菌也可有不同特點(diǎn)的形態(tài)。因此，在真菌的實(shí)驗(yàn)室檢查中，必須熟練掌握各類真菌的形態(tài)特征以及在不同條件下的演變規(guī)律，才能獲得對(duì)致病真菌正確的診斷。目前真菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢查方法主要包括常規(guī)檢查法和特殊檢查法兩類。常規(guī)檢查法主要包括：①形態(tài)學(xué)檢查(直接鏡檢+染色鏡檢)。②培養(yǎng)檢查。③組織病理學(xué)檢查。特殊檢查主要包括：①血清學(xué)方法。②分子生物學(xué)方法。 一、進(jìn)行真菌實(shí)驗(yàn)室診斷的注意事項(xiàng) ①應(yīng)有獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室，不應(yīng)與其他細(xì)菌、病毒等實(shí)驗(yàn)室共用，以防發(fā)生相互污染。②在每天工作前與工作后，工作臺(tái)均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%過氧乙酸擦拭，如遇操作臺(tái)被真菌或標(biāo)本污染，應(yīng)即覆蓋紙巾，并用5%石碳酸消毒20min，切忌工作臺(tái)污染后即用水沖洗，以免污染擴(kuò)散。③培養(yǎng)菌檢體及真菌污染的物質(zhì)在丟棄前，必須高壓滅菌或焚燒。④在進(jìn)行真菌檢查時(shí)，不可試著聞平板培養(yǎng)基特殊的氣味。⑤不可對(duì)Histoplasma capsulatum 以及 Coccidioides immitis進(jìn)行載玻片培養(yǎng)技術(shù)，因?yàn)槠涞染哂懈叨雀腥拘缘逆咦幽軌螂S著空氣傳播。⑥實(shí)驗(yàn)室禁止任意養(yǎng)花、草、動(dòng)物等生物，以防實(shí)驗(yàn)污染。⑦工作環(huán)境應(yīng)定期消毒。一般紫外線照射不能殺滅真菌，應(yīng)用40%甲醛(可于每4㎡空間用35ml 40%甲醛加18g高錳酸鉀在密閉情況下熏蒸24h，或用環(huán)氧乙烷進(jìn)行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培養(yǎng)基接種標(biāo)本，必須將平板培養(yǎng)基密封，以免發(fā)生危險(xiǎn)，在不常做真菌檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，最安全的培養(yǎng)方法是利用含有棉花塞的試管培養(yǎng)基(使空氣能夠循環(huán))。⑨美國梅育診所主張利用平板培養(yǎng)基進(jìn)行真菌的分離，步驟如下:平板培養(yǎng)基必須在生物安全箱內(nèi)操作及檢查。平板培養(yǎng)必須用膠帶封好，平板培養(yǎng)基必須含30ml的量，并保持培養(yǎng)箱60%以上的濕度，同時(shí)增加瓊脂的濃度至2%，以免脫水。⑩真菌的診斷，需要經(jīng)驗(yàn)的累積及備有良好的圖譜參考書。 二、分離及鑒定真菌的培養(yǎng)基 (一)配制培養(yǎng)基的一般原則 ①各成分混勻后以文火緩慢加熱，并不斷攪拌，煮沸1min，過熱會(huì)破壞有效成分。②分裝試管應(yīng)在高壓滅菌前，而分裝平皿應(yīng)在高壓滅菌后。③高壓滅菌一般在118～121磅,10～15min。④需加血液或不能高壓的成分如抗生素，應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至50 左右時(shí)加入混勻。⑤試管分裝量約7~8ml，平皿約15ml,如需培養(yǎng)4～6周，平皿內(nèi)應(yīng)有35～40ml的量。培養(yǎng)基中抗生素的濃度和添加方法：氯霉素、慶大霉素和放線菌酮能耐熱，可在培養(yǎng)基高壓滅菌前加入，其他抗生素均在培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至45℃～50℃時(shí)加入。青霉素20～100μg/ml，鏈霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放線菌酮500μg/ml，慶大霉素5μg/ml。 (二)分離和鑒定真菌的培養(yǎng)基 各種醫(yī)學(xué)真菌所用培養(yǎng)基的成分，又可根據(jù)不同要求，分成分離、富集、選擇、特性研究等含不同成分培養(yǎng)基，具體見表。 表 分離鑒定真菌培養(yǎng)基分類表 培養(yǎng)基種類 分離用培養(yǎng)基 使用目的 1.Brain heart infusion agar 分離腐生性及病原性真菌 區(qū)分試驗(yàn)培養(yǎng)基 1.Ascospore agar 檢測(cè)產(chǎn)子囊孢子酵母菌 三、臨床樣本的采集與處理 (一)皮屑 邊緣、皰壁、膿液、深層趾(指)間皮屑或活動(dòng)邊緣皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同時(shí)種于沙氏瓊脂加氯霉素2管，置25℃培養(yǎng)2周。 (二)甲屑 用細(xì)挫或牙科磨鉆取病甲與正常甲交界處并且貼近甲床部的甲屑，標(biāo)本用酒精浸泡待干燥后種于沙氏(SDA)培養(yǎng)4周，并同時(shí)作KOH涂片。 (三)毛發(fā) 取病發(fā)(變色，無光澤，彎曲，脆易折斷，松動(dòng)易拔除)15根，75%酒精消毒，3～5根作直接鏡檢，5～10根種于沙氏瓊脂(加氯霉素)，劃破斜面掩埋。 (四)膿液 無菌采集，注意顆粒，用無菌蒸餾水稀釋后尋找。可作G染色或抗酸染色，常規(guī)的KOH涂片及SDA接種培養(yǎng)也是必要的。 (五)CSF 采集于無菌試管3～5ml，立即送檢。置冰箱不宜超過1h。離心后以無菌吸管吸取離心沉淀物1ml，作墨汁涂片鏡檢和培養(yǎng)(SDA)25℃或37℃4周。 (六)血液 無菌抽血3～5ml立即于無菌抗凝管中，BHIB:血標(biāo)本量為培養(yǎng)基量的1/10，37℃5～7d出現(xiàn)渾濁或菌團(tuán)，挑取鏡檢同時(shí)移種SDA(注：每天檢查完畢后需搖動(dòng)培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)可加速真菌的生長，提高檢出率。不作直接檢查，因其直接檢查陽性率低（血細(xì)胞分析儀）。 (七)體液、痰液、尿液、糞便 ①體液標(biāo)本量10ml離心沉淀取2ml沉淀液做直接鏡檢培養(yǎng)。②晨痰3～5ml集于無菌瓶中(無菌生理鹽水漱口數(shù)次后)，挑取黏液或膿性部分：KOH涂片培養(yǎng)。③早晨中段尿或清潔尿10ml，離心取沉淀液1ml做KOH涂片培養(yǎng)(SDA每管種0.5ml)。④拭子：一般盡量不用，缺點(diǎn)：A.不能得到足量的標(biāo)本；B.采集的標(biāo)本也不易從棉花纖維上分離下來;C.容易干竭。采集標(biāo)本后應(yīng)迅速放入內(nèi)裝1~2ml無菌蒸餾水的試管送檢KOH涂片培養(yǎng)。⑤紙盒送檢，挑取黏液、膿血、乳酪樣部分KOH涂片培養(yǎng)(加抗生素)注：單純培養(yǎng)陽性，不一定有臨床意義，KOH涂片發(fā)現(xiàn)菌絲，有診斷意義。 (八)組織：標(biāo)本置無菌平皿中立即送檢，置無菌勻漿器加2ml蒸餾水，研磨成漿或1～2mm3的小塊，KOH涂片培養(yǎng)。 四、真菌學(xué)檢驗(yàn)的基本技術(shù) (一)直接鏡檢 是最簡單也是最有用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，常用的方法有：①氫氧化鉀/復(fù)方氫氧化鉀法：標(biāo)本置于載玻片上，加一滴浮載液，蓋上蓋玻片，放置片刻或微加熱，即在火焰上快速通過2～3次，不應(yīng)使其沸騰，以免結(jié)晶，然后輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡并將標(biāo)本壓薄，用棉拭或吸水紙吸去周圍溢液，置于顯微鏡下檢查。檢查時(shí)應(yīng)遮去強(qiáng)光，先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、位置、大小和排列等。浮載液：A.10%~20%的KOH。配方：氫氧化鉀10～20g，蒸餾水加至100ml，待氫氧化鉀完全溶解后揺勻存放在塑料瓶內(nèi)，適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痂皮、痰、糞便、組織、耵聹等的檢查。B.復(fù)方氫氧化鉀溶液配方：氫氧化鉀(AR)10g，二甲基亞砜(AR)40ml,甘油50ml, 蒸餾水加至100ml,配制方法：將氫氧化鉀先加入30ml蒸餾水中溶解后，再依次加入DMSO、甘油揺勻后，用蒸餾水加到100ml，裝入塑料瓶內(nèi)。此配方的優(yōu)點(diǎn)是：配方中加DMSO，能促進(jìn)角質(zhì)的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氫氧化鉀結(jié)晶，氫氧化鉀的濃度相對(duì)低，腐蝕性亦低，為進(jìn)行大面積普查或大批量采集標(biāo)本作鏡檢帶來了方便。②膠紙粘貼法：用1cm×1.5cm的透明雙面膠帶貼于取材部位數(shù)分鐘后自取材部位揭下，撕去復(fù)帶在上面的底板紙貼在載玻片上，使原貼在取材部位的一面暴露在上面，再進(jìn)行革蘭染色或過碘酸錫夫染色，在操作過程中應(yīng)注意雙向膠帶粘貼在載玻片上時(shí)不可貼反，而且要充分展平，否則影響觀察。③涂片染色檢查法：在載玻片上滴1滴生理鹽水，將所采集的標(biāo)本均勻涂在載玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再選擇適當(dāng)?shù)娜旧椒ǎ旧螅愿弑剁R或油鏡觀察。 常見鏡檢染色方法有：①革蘭染色。所有真菌、放線菌均為革蘭染色陽性，被染成藍(lán)黑色。適用于酵母菌、孢子絲菌、組織孢漿菌及諾卡菌、放線菌的感染。②乳酸酚棉藍(lán)染色：用于各種真菌培養(yǎng)物的鏡檢。③印度墨汁：用于檢測(cè)腦脊液(CSF)中的新生隱球菌。④抗酸染色：用于抗酸菌及諾卡菌的診斷。⑤瑞氏染色：用于組織胞漿菌和馬內(nèi)菲青霉的檢測(cè)。⑥過碘酸錫夫染色(PAS)：用于體液滲出液和組織勻漿等。真菌胞壁中的多糖染色后呈紅色，細(xì)菌和中性細(xì)胞偶可呈假陽性，但與真菌結(jié)構(gòu)不同，不難區(qū)別。⑦嗜銀染色(GMS)：真菌可染成黑色，主要用于測(cè)定組織內(nèi)真菌。 (二) 真菌培養(yǎng) 從臨床標(biāo)本中對(duì)致病真菌進(jìn)行培養(yǎng)，目的是為了進(jìn)一步提高對(duì)病原體檢出的陽性率，以彌補(bǔ)直接鏡檢的不足，同時(shí)確定致病菌的種類。真菌培養(yǎng)檢查除需要一般細(xì)菌檢驗(yàn)用到的器具外，還應(yīng)準(zhǔn)備真菌專用的接種針、接種環(huán)、或接種鉤(用鉑絲或鎳絲制成)、微型小鏟、刀片、針頭等，常規(guī)分離鑒定使用的培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)斜面培養(yǎng)基，加0.05%氯霉素，還有多種性質(zhì)的培養(yǎng)基(見第二部分)以滿足各種不同的需要，可酌情選用接種的方法，根據(jù)不同的臨床標(biāo)本，大體可分為點(diǎn)植法和劃線法兩種。①點(diǎn)植法：適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痂皮、組織等有形固體標(biāo)本，將標(biāo)本直接與培養(yǎng)基表面點(diǎn)狀接觸。②劃線法：適用于痰、分泌物、膿液、組織液、組織塊的研磨液等液體標(biāo)本，用接種針(環(huán))劃線接種在培養(yǎng)基表面。 培養(yǎng)方法有多種，接臨床標(biāo)本接種時(shí)間分為直接培養(yǎng)法和間接培養(yǎng)法；按培養(yǎng)方法分為試管法、平皿法(大培養(yǎng))和玻片法(小培養(yǎng))。①直接培養(yǎng)：采集標(biāo)本后直接接種于培養(yǎng)基上。②間接培養(yǎng)：采集標(biāo)本后，暫保存，以后集中接種。③試管培養(yǎng)：是臨床上最常用的培養(yǎng)方法之一，培養(yǎng)基置于試管中，主要用于臨床標(biāo)本分離的初代培養(yǎng)和菌種保存。④大培養(yǎng)：將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)皿或特別的培養(yǎng)瓶內(nèi)，主要用于純菌種的培養(yǎng)和研究。⑤小培養(yǎng)：主要用于菌種鑒定，大致分為三種：玻片法，方塊法和鋼圈法。A.玻片法：在消毒的載玻片上，均勻地澆上熔化的培養(yǎng)基，不宜太厚。凝固后接種待鑒定菌株，置于平皿中，保濕。待有生長后，蓋上消毒的蓋玻片，顯微鏡下直接觀察，常用米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基觀察白念珠菌的頂端厚壁孢子和假菌絲。B.方塊法：適用于霉菌菌落的培養(yǎng)。取無菌平皿倒入約15ml熔化的培養(yǎng)基，待凝固后用無菌小鏟或接種刀劃成1cm2大小的小塊。取一小塊移在無菌載玻片上，然后在小塊上方四邊的中點(diǎn)接種待鑒定菌株，蓋上消毒的蓋玻片，放入無菌平皿中的V形玻棒上，底部鋪上無菌濾紙，并加入少量無菌蒸餾水，孵育，待菌落生長后直接將載玻片置顯微鏡下觀察。C.鋼圈法：先將固體石蠟加熱熔化，取直徑約2cm，厚度約0.5cm有孔口的不銹鋼小鋼圈，火焰消毒后趁熱浸入石蠟油，旋即取出冷卻，石蠟油即附著于小鋼圈中。再取一無菌載玻片，火焰上稍加熱，將小鋼圈平置其上，孔口向上。小鋼圈上石蠟油遇載玻片的熱即熔化后凝固，鋼圈就會(huì)固定在載玻片上。用無菌注射器經(jīng)孔口注入熔化的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量約占小鋼圈容量的1/2，注意避免氣泡。待培養(yǎng)基凝固后取一消毒蓋玻片，火焰上加熱后，趁熱蓋在小鋼圈表面，也即固定其上。最后用接種針伸入孔口進(jìn)行接種。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是形成一種封閉式培養(yǎng)，在顯微鏡下直接觀察菌落時(shí)可避免孢子吸入人體，而且不易被污染，蓋玻片也可取下染色后封固制片保存。 (三)培養(yǎng)檢查 標(biāo)本接種后，每周至少檢查2次，觀察以下指標(biāo)：①菌落外觀：A.生長速度：緩慢生長菌：7～14d，快速生長菌：2～7d。一般淺部真菌超過2周深部真菌超過4周仍無生長，可報(bào)告陰性。B.外觀：a.扁平。b.疣狀。c.折疊規(guī)則或不規(guī)則。d.纏結(jié)或墊狀。e.其他。C.大小：菌落大小用cm來表示，菌落大小與生長速度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。D.質(zhì)地：a.平滑狀。b.粉狀。c.粒狀。d.棉花狀。e.粗毛狀。f.皮革狀。g.粘液狀。h.膜狀。E.顔色：不同的菌種表現(xiàn)出不同的顔色，呈鮮艷或暗淡。致病性真菌的顔色多較淡，呈白色或淡黃色，而且其培養(yǎng)基也可變色，如馬爾尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有顔色，其背面也有深淺不同的顔色。菌落的顔色與培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、移種代數(shù)等因素有關(guān)。所以，菌落的顔色雖在菌種鑒定上有重要的參考價(jià)值，但除少數(shù)菌種外，一般不作為鑒定的重要依據(jù)。F.菌落的邊緣：有些菌落的邊緣整齊，有些不整齊。G.菌落的高度和下沉現(xiàn)象：有些菌落下沉現(xiàn)象明顯，如黃癬菌、絮狀表皮癬菌等，更有甚者菌落有時(shí)為之裂開。H.滲出物：一些真菌如青霉、曲霉的菌落表面會(huì)出現(xiàn)液滴。I.變異：有些真菌的菌落日久或多次傳代培養(yǎng)而發(fā)生變異，菌落顔色減退或消失，表面氣生菌絲增多，如絮狀表皮癬菌在2～3周后便發(fā)生變異。②顯微鏡檢查：小培養(yǎng)可置普通顯微鏡下直接觀察，而試管和平皿培養(yǎng)的菌落則需挑起后做涂片檢查。 五、組織病理學(xué)檢查 真菌病的組織病理檢查與直接鏡檢培養(yǎng)同樣具有相當(dāng)重要的價(jià)值，尤其對(duì)深部真菌病的診斷意義更大，如用特殊染色可提高陽性率。 真菌的組織病理反應(yīng)與其他一些疾病的組織病理反應(yīng)極其相似，往往只有在仔細(xì)研究了病理切片并發(fā)現(xiàn)了真菌之后才考慮到真菌病的診斷。而在這種情況下，標(biāo)本已被固定，培養(yǎng)有時(shí)已不可能進(jìn)行，組織病理切片就成了真菌感染的主要依據(jù)。所以臨床上在送病理標(biāo)本的同時(shí)，要盡可能考慮到真菌感染的可能，以便同時(shí)采集標(biāo)本送真菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行真菌學(xué)檢查。 真菌在組織內(nèi)一般表現(xiàn)為：①孢子：酵母和雙相型真菌在組織內(nèi)表現(xiàn)為孢子。②菌絲：許多真菌在組織中只表現(xiàn)為菌絲。組織中發(fā)現(xiàn)無色分隔、分支的菌絲多為念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分支的菌絲為接合菌，多為毛霉、根霉、犁頭霉等。粗大、少分支有隔的菌絲為蛙糞霉菌。棕色菌絲為暗色絲孢霉病，由暗色孢科真菌引起。③菌絲和孢子，主要見于念珠菌感染。④顆粒：為組織內(nèi)由菌絲形成的團(tuán)塊。⑤球囊或內(nèi)孢囊：球囊內(nèi)含有內(nèi)孢子，為球孢子菌或鼻孢子菌在組織內(nèi)的特征性結(jié)構(gòu)。 組織病理片中根據(jù)形態(tài)和染色能基本確定種名的真菌為：莢膜組織胞漿菌、杜波伊斯組織胞漿菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、鏈狀芽生菌、粗球孢子菌、新生隱球菌和鼻孢子菌等。根據(jù)組織病理中真菌的形態(tài)能確定屬而不能確定種的病為：放線菌病、奴卡菌病、無綠藻病、念珠菌病、曲霉病和不育大孢子菌病等。多個(gè)屬的真菌感染可引起相同的臨床表現(xiàn)，在組織病理中真菌的形態(tài)無法區(qū)別的病有皮膚著生芽生菌病、暗色絲孢霉病、接合菌病、皮膚癬菌病和足菌腫等。足菌腫的顆粒若染色適當(dāng)，很易確定為放線菌性或真菌性的，也能區(qū)別出細(xì)菌性顆粒。真菌性顆粒中的菌絲又分為無色或暗色兩大類。各種病原菌基本上形成各自顔色、大小、形成和結(jié)構(gòu)的顆粒，可以初步區(qū)別，但最后確定必須依靠真菌培養(yǎng)。 六、血清學(xué)方法 隨著診斷技術(shù)的進(jìn)展，以免疫學(xué)方法檢測(cè)真菌病已成為可能，引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌、曲霉菌和隱球菌等，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要為血培養(yǎng)和組織活檢，但血培養(yǎng)歷時(shí)太長，且深部真菌感染的病原菌常不易培養(yǎng)成功，陽性率較低。而深部真菌感染的臨床征象錯(cuò)綜復(fù)雜，又使得組織活檢缺乏典型改變，影響正確診斷，這些都使得這些方法所起的作用極為有限，真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學(xué)檢查用于深部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，可取得很好的效果。目前常用的免疫診斷方法有：①特異性抗原的檢測(cè)：A.乳膠凝集試驗(yàn)(LA)。B.酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(EIA)。C.熒光免疫測(cè)定法(FA)。②特異性抗體檢測(cè)：由于受檢者都為免疫低下患者，因其致陽性率低，故現(xiàn)已少用。（酶標(biāo)儀） 七、分子生物學(xué)方法 近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已有聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、分子探針、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、DNA指紋圖譜、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)等方法。用于深部真菌病的診斷和分型研究，形成了以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的一系列分子診斷方法。從這些新技術(shù)對(duì)多種致病真菌鑒定的應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，此類方法具有操作簡便、省時(shí)省力、特異性、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。特別是從分子水平對(duì)真菌從遺傳進(jìn)化角度闡明菌種間內(nèi)在的分類學(xué)關(guān)系，真正達(dá)到人們追求已久的自然分類的目的。我們有理由相信，隨著PCR及相關(guān)技術(shù)在臨床的應(yīng)用及更廣泛深入的研究，將會(huì)對(duì)真菌感染的診斷和鑒定產(chǎn)生根本的影響。 文章來源---南京普朗醫(yī)療器械公司網(wǎng)編! |
